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WANZHAN 发表于 07-8-11 15:48

DNA重组主要实验

[align=center][b]DNA重组主要实验[/b][/align]的主要内容：
Dl5M$Td O [list=1][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31497][size=3][color=blue][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]重组技术常用酶[/font][/color][/size][/url][font=宋体][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31499][size=3][color=blue]酶切基础知识[/color][/size][/url][font=宋体][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31500][size=3][color=blue]双酶切反应[/color][/size][/url][font=宋体][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31501][size=3][color=blue]影响限制性内切酶活性的因素[/color][/size][/url][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31502][size=3][color=blue][font=宋体]电泳洗脱法回收酶切[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段[/font][/color][/size][/url][font=宋体][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31503][size=3][color=blue]连接酶简介[/color][/size][/url][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31504]连接试验[/url][/color][/size][/font][font=宋体][font=宋体][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31508][size=3][color=blue]连接反应的影响因素[/color][/size][/url][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=1#pid31509]感受态细胞常用的制备方法[/url][/color][/size][/font][font=宋体][font=宋体][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31510][size=3][color=blue]高效感受态细胞制备[/color][/size][/url][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31511][size=3][color=blue][font=Times New Roman]Inoue[/font][font=宋体]法制备大肠杆菌超级感受态细胞[/font][/color][/size][/url][font=宋体][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31512][size=3][color=blue]感受态细胞转化效率的检验[/color][/size][/url][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31513][size=3][color=blue][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]的转化[/font][/color][/size][/url][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31516]质粒的酵母直接转化[/url][/color][/size][/font][font=宋体][font=宋体][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31519][size=3][color=blue]感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议[/color][/size][/url][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31521]几种常见转化细胞及转化技术[/url][/color][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31522][size=3][color=blue]转化要点及疑难解析[/color][/size][/url][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31524][color=blue][size=3][font=宋体]转化子[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][/size][font=宋体][size=3]的鉴定[/size][/font][/color][/url][font=宋体][font=宋体][size=10.5pt][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][color=blue][size=10.5pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=2#pid31529]重组子的筛选[/url][/size][/color][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=10.5pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8164&page=3#pid31530][color=blue][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]重组实验常见问题分析[/font][/color][/url][/list][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font]jqj9K+E|6UVA8U
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声明：~!AG~t\M0~
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{~zTN#N!y@/d 致谢：}\T }Z7|;kO0O
整理者：WANZHAN  审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige887U&DnX@
主要参考资料：《分子克隆试验指南》
`i6zU&xm5L [list=1][color=#000000][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=10.5pt][/list][/size][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/color]'|&o"Y4I%?f6oN2Z7\

BMN?'F1rlR(H [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 09:07 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 16:27

DNA重组技术常用酶

**** Hidden Message *****
S)aZ,\+mav|#C%F*K xf'n#~'`@
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:47 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 16:40

酶切基础知识

**** Hidden Message *****$I|F_ u }D3VIn
n6yy`\&`TQ
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:47 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:24

双酶切反应

**** Hidden Message *****
!|(WewZA3e.@/Q
-D O8}*V g.P/u HD [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:48 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:26

影响限制性内切酶活性的因素

**** Hidden Message *****
Ha`-r1~E3u
S,d&{9JS"I[ [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:48 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:28

电泳洗脱法回收酶切DNA片段

[align=center][b]电泳洗脱法回收酶切DNA片段[/b][/align]8{6dF~+fMg(i8T
1、 用合适的酶切割DNA并电泳。
9~P3D` v 2、 于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。%K&OX/F)g"v&N!p
3、 将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。t-u!mk8I-pV
4、 取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。
'[X*Mk([%[%lL*B"g 5、 吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。
l2_2H9za7o;T^p+Y y 6、 加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。
.K4g+Xt`@ 7、 于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。
9] EmGu s4_.b 8、 用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
%|+tIu9P~xW 9、 真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:40

连接酶简介

**** Hidden Message *****
'Kf \*tI$?
:J*c |&@Q"v8o [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:49 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:45

连接试验

**** Hidden Message *****
5]9Y)O AwoDj "T}eo!`&qxG JiG1U
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[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:50 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:54

连接反应的影响因素

**** Hidden Message *****_N/NXR,h'L

;[ru8gqvN [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:50 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 17:59

感受态细胞常用的制备方法

**** Hidden Message *****
\
nC q%iN(n
)v'P8N]y!_~6Ax [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:51 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:01

高效感受态细胞制备

[align=center][b]高效感受态细胞制备[/b][/align]
l&K]9|"`4Cn:YM **** Hidden Message *****
Q+@'k,R
VjF {8{ x9K s"fQ p)s
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:52 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:05

[align=center][b]Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞[/b][/align]r9at i9?%g
**** Hidden Message *****

zC/A2?_x ,[_n5q3J7Cv;g"@
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:52 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:06

感受态细胞转化效率的检验

[align=center][b]感受态细胞转化效率的检验[/b][/align]M3h m9d&]t
　　为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率.计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
YM(k4W2q+tC J 例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞. 向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg.
Z:c f#b&o"Cf;nB4z 转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×108 cfu/μg DNA。

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:11

DNA的转化

**** Hidden Message *****
3zM,p*F3R
.PB9t'HiF1M] [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:53 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:12

质粒的酵母直接转化

**** Hidden Message *****
"rm6^ Z{ r~.D:jA
STs,}7N2L%Je8X [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:53 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:14

感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议

**** Hidden Message *****bf#k2w(I+l
]ZY+OM2\&X
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:54 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:17

几种常用转化细胞和转化技术

**** Hidden Message *****6kw5U$c.K1je

7xt]g6I X(M6YVk [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:54 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:20

转化要点及疑难解析

**** Hidden Message *****$H_/pYBCfmc%C

(q"U4bd3N8w2_ [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:55 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:22

转化子DNA的鉴定

**** Hidden Message *****
c6R~;P{XGTr$gs3E
4DH3q^O [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:55 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-11 18:25

重组子的筛选

**** Hidden Message *****
^q(Ap9r;J \ ~X"~?
Nx S!Oe|EA6Q [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:56 编辑 [/i]]

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