核酸电泳
[align=center][b]核酸电泳[/b][/align][align=left]主要内容： X F8L)xs8l _y
[/align][list=1][*][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31444]电泳技术概述[/url][/color][/size][/font][font=宋体][/font][*][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31447][size=3][color=blue]凝胶电泳的实验原理[/color][/size][/url][/font][font=宋体][font=宋体][/font][/font][*][font=宋体][font=宋体][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31448][size=3][color=blue]核酸电泳指示剂的选择[/color][/size][/url][/font][/font][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31449]琼脂糖凝胶电泳[/url][/color][/size][/font][/font][/font][font=宋体][size=3][color=blue][/color][/size][/font][*][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31450]琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项[/url][/color][/size][/font][font=宋体][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31451]琼脂糖凝胶电泳迁移速率的影响因素[/url][/color][/size][/font][/font][font=宋体][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][size=3][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31452][color=blue][font=宋体]从普通琼脂糖凝胶电泳中用玻璃奶回收[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段[/font][/color][/url][/size][/font][/font][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][/color][/size][/font][/font][/font][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31453]聚丙烯酰胺凝胶电泳[/url][/color][/size][/font][/font][/font][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=1#pid31458][color=blue][font=宋体]聚丙烯酰胺凝胶电泳[/font][font=Times New Roman]PAGE[/font][font=宋体]胶的配制[/font][/color][/url][/size][/font][/font][/font][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=2#pid31459][color=blue][font=Times New Roman]RNA[/font][font=宋体]凝胶电泳[/font][/color][/url][/size][/font][/font][/font][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][/size][/font][/font][/font][/font][color=blue] [/color][*][font=宋体][font=宋体][font=宋体][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=2#pid31460]凝胶电泳的注意事项[/url][/color][/size][/font][/font][/font][/font][font=宋体][size=3][color=blue][/color][/size][/font][*][font=宋体][size=3][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8159&page=2#pid31464]凝胶电泳常见问题分析[/url][/color][/size][/font][/list]N$}3T-[V*y.tx M
声明： |&g SX d'u$hMz
1、 本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本书的工作人员；若本书侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email [email=genecool@126.com]genecool@126.com[/email]告知。 j&G1MROaU.X8\
2、 由于我们的学识、经验有限，本书难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（[url=http://www.genecool.com/bbs]www.genecool.com/bbs[/url]）本篇对应的专题跟贴指出或Email [email=genecool@126.com]genecool@126.com[/email]。
致谢：0H)m!eN8Y'do}
整理者：WANZHAN 审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige88s){Je+dgXE
主要参考资料：《分子克隆试验指南》
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:05 编辑 [/i]]
电泳技术概述
[align=center][b]电泳技术概述[/b][/align]8Nm$d0? U V Rs%@电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm 14 cm，厚度为1mm～2? mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。
在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：F’=6πrηυ式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F’，q?E = 6πrηυ由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。-B3{ c~5|
用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，实际使用的是相对迁移率mR。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
凝胶电泳的实验原理
**** Hidden Message *****Q t8_-MR!o
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:05 编辑 [/i]]
核酸电泳指示剂的选择
[align=center][b]核酸电泳指示剂的选择[/b][/align][b]指示剂：[/b]4K!~,tW]0N
核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。as%?r cV4c5|
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有：8P~:{k I+X
1、 增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 e7yz4h R7?s
2、 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置。9B }?%{4g q!g{5[0M
3、 使样品呈色，使加样操作更方便。 e.D rk F s9^4]
[b]染色剂：[/b]3q8z,JUo lJz t'v
核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。
银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。
琼脂糖凝胶电泳
**** Hidden Message *****3e8w#R:S6^r V7z5?L
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:05 编辑 [/i]]
琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项
[align=center][b]琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项[/b][/align]F b+OS&fy4q)zN%\DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量。小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度，例如质量浓度3mg/ml的琼脂糖用来做DNA大片段电泳（>20 000碱基）而0.8%只能电泳小的片断。
要注意以下几点：4X1S d2b,~ J%?
1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。:I)XG.v i#{0|h g
2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。(T&`]L/S-hK
3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。}$v.wd9R
4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。
5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。
6、 电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 Pbr]] vO9]v
7、 在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。^#t4Gbe
8、 如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
A z,o L9ID5Mg
[b]其他注意事项：}0]*V,jF R q;ct
[/b]1、 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。Q3Ip|U f ~
2、 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。V:Z f&S,k.d{:r
3、 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。5t#zboI!Ug
4、 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖凝胶电泳迁移速率的影响因素
**** Hidden Message *****UXBNG \ Q.J;I2i@7E/E0{8t @d2S
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:06 编辑 [/i]]
从普通琼脂糖凝胶电泳中用玻璃奶回收DNA片段
[align=center][b]从普通琼脂糖凝胶电泳中用玻璃奶回收DNA片段[/b][/align]A;cV/O `1`8lo[b]实验步骤：FmS"z\2b t0i)e
[/b]1、 待回收的DNA片段经电泳分离后，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml EP管中；2Z NQU)mw)bd4wK
2、 加入3 倍（请准确估量凝胶的体积）体积的溶胶液（以100μl 体积胶加入300μl 溶胶液为一次标准反应），室温下放置5分钟或50℃ 保温3分钟，其间轻摇EP管几次使胶完全融化；
3、 加入10μl玻璃奶（玻璃奶使用前请充分摇匀），颠倒混匀，冰浴下放置10分钟。每隔2~3分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清；*]3Xfj R op
4、 加250μl漂洗液（浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂洗液：无水乙醇= 3：7配制成工作浓度），用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30 秒，吸弃上清；n5M'Ql;zJ3A*K*g e c
5、 重复步骤4（尽量吸尽漂洗液）。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用Tip头将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37℃烘箱干燥直至沉淀呈白色，约15~20分钟；V#Sqx B\ F-b
6、 加适量洗脱缓冲液即无菌水（20μl为一次标准反应），混匀，60℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟，回收上清备用。重复步骤6，能提高回收率。R3n+whV2??5L N
7、 同原质粒一起琼脂糖凝胶电泳鉴定回收片段。根据亮度可以估计回收的量。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
[align=center][b]聚丙烯酰胺凝胶电泳[/b][/align][b]实验试剂：[/b]4b/]z,s;l(m!fU
试剂贮备液：e J,|@ j S.v2c)V8X
1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。 K8y%\+v_.y8M
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。h g(q [{dJ
4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。$O:f ? E v4@
5、 核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。O*\5W+N y Pp%q3y
6、 蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。 | \ `8^ K6[ iJ X
7、 电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。
8、 过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。[g2J?0R ^
9、 溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。']!s(? y5X H%p,_,le
10、 脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。
11、 蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水
80ml，溶解后混合之。
12、 过氧化物酶染色液：
1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。UX;|#e[A x/`\ V:m
2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
[b]实验步骤：
[/b][b]凝胶的制备：:mI:zV;DYk C!k
[/b]1、 清洗干净两块玻璃板，晾干后按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。i L2[O2Hy,H
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌胶支架上固定好。$^I0}/WY#c"L
3、 分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液1，3和水放在一小烧杯中，过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将过硫酸铵溶液并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离玻璃板口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。[%e B/G)u
4、 浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟。
[b]电泳步骤：``Ph_cpax vP
[/b]1、 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。
2、 用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。tN(y&x HE
3、 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
4、 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 ]W Rzx+Pp``1m
5、 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到区带清晰。f$}J:Q"R@ ^q(p
6、 实验结果分析。LY'io4Z;G5{pXA
[b]注意事项：[/b]
1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。x}}2_:em C Fe
3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。
4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。E)E }/B5M8H9X5s
5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。&N,U] i a
6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。
8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE胶的配制
**** Hidden Message *****6y-i8A Y |s7e9Ca)V9i1P(`:Dpa
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:06 编辑 [/i]]
RNA凝胶电泳
[align=center][b]RNA凝胶电泳[/b][/align][b]实验基本原理：[/b]'q }r2N-EAH ]\
RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。
判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。
V!J,d%^3j#q` ?
[b]实验试剂：
[/b]1、 0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。o'T-|:?/^S5z
2、 10x电泳缓冲液：吗啉代丙烷磺酸（MOPS）0.4mol/L（pH 7.0）；NaAc 0.1mol/L；
乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L；
3、 50mL变性琼脂糖凝胶（1%）：10x电泳缓冲液5 mL；琼脂糖0.5 g；0.1%DEPC水36.5 mL；
加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。?
4、 上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。7?'N(J5uBS5_7G
5、 甲酰胺（去离子）。
'}:bE8[h%Wv
[b]操作步骤：[/b]
1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。jp U M,c1z'~ F
2、 制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
3、 加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
4、 电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。
5、? 电泳结束后通过紫外透视仪观察。_]~/R Rt-^
[b]注意事项：[/b]
本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。
凝胶电泳的注意事项
[align=center][b]凝胶电泳的注意事项[/b][/align])Q;C)`Q@ nc[b]影响电泳分离的主要因素：
[/b]1. 待分离生物大分子的性质：待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，6g*f8w DnB;e-n
子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。R `h3KT'R
2. 缓冲液的性质：缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
3. 电场强度：电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：W=I2.R.t式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。 h LM!Yb
电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：;N O[z XE
1、 样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；/b!Ze"s0u9D? z
2、 产生对流，引起待分离物的混合；Pf-m Y3oy x3V ~
3、 如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；
4、 引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
4. 电渗：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。7}2vI] J]?
5. 支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。dU;j3_g9T/D u-B
x'H@#a&m
[b]关于胶回收切胶的一点注意事项：[/b]
1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。
2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。
4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。
凝胶电泳常见问题分析
[align=center][b]凝胶电泳常见问题分析[/b][/align][color=blue]要跑琼脂糖凝胶电泳， 5ng 就能很清楚的跑出来是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？[/color]
参考见解：5ng 已经可以了，但是或许20ng50ng-200ng效果好，在此范围内呈线性。-QZw3`+MXU
[color=blue]把210bp的pcr产物进行酶切,得到190+20bp的两个片段,请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗?用多大浓度的胶和多大的电压呢?
[/color]参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开,电压不变,可用1.5%到2%的胶,20bp得片断不一定能看得到,所以应用未酶切的PCR片断作对照.
[align=center][table][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]琼脂糖浓度（W/V）[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]大小范围（bp）[/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]0.6%[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]1000-23000[/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]0.8%[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]800-10000[/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]1.0%[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]400-8000[/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]1.2%[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]300-7000[/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]1.5%[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]200-4000[/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]2%[/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,201][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt]100-3000[/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][/table][/align] 丙烯酰胺凝胶电泳更适合于分离纯化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以达到1个bp。所以建议进行丙烯酰胺凝胶电泳试试。
[color=blue]Marker做琼脂糖凝胶电泳，发现Marker在加样孔有一个明显的亮带，什么原因？ A'\ ^ B i,SNo
[/color]参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。
[color=blue][/color]
[color=blue]琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?
[/color]参考见解： DNA带模糊??：
1、 DNA降解??避免核酸酶污染。
2、 DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、 所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、 DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、 有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。U tX T$ga
6、 DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
[color=blue]将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来，是怎么回事？
[/color]参考见解：w tIF6z fK`
1、 根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。 C9wB Ir6u.fq
2、 紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
3、 最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。
4、 电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。9}2iYa;}6|Q
cZ&KH7y&`5I A3}
[color=blue]内切酶酶切后应该产生300+74+25bp的3个片段，用琼脂糖凝胶电泳能不能跑得开？如果能，得用多少浓度？
[/color]参考见解：:bh8B)vt? V l"@
1、 分是分的开的，只是不知道要不要看到这条带，如果只是对多个样本的分析的，那是完全没有问题的。用2.5~3.0%的胶跑过，不同样本间是肯定看的到的。当然，25BP这条带是看不到的。
2、 用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行电泳分离，可以分开的。不过缓冲液要用0.5的TBE，不要用TAE，其效果差些。下面是10ml的配方：
[align=center]
30％丙烯酰胺母液 3.3 ml
5 × TBE 1ml
10% A.P 70 ulV |5vJ!lo%f
TEMED 5ul
120v 1.5h E0N)@+B b ^
[/align]8}So Wzt
[color=blue]在pH7.6的TBE缓冲液中进行质粒（DNA）的琼脂糖凝胶电泳时质粒向哪一极运动，为什么？如在DNA样品中加足够的亚精氨后再电泳会发生什么现象，为什么？
[/color]参考见解：
1、 DNA分子在碱性凝胶缓冲液中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。ASM9l%@ }-A
2、 样品中加足够的亚精氨后,亚精胺头部的强阳极性使整个分子高度亲和于DNA，DNA与碱性亚精胺结合,结合分子带阳离子。
[color=blue]在琼脂糖电泳时0.5CM孔DNA上样量不宜超过500ng;可是当组分不同时可加20~30ug这是怎么回事?
[/color]参考见解：单个条带不超过500ng，如果有很多条带的话，总量500ng可能就会少了点，条带不清晰。!H F)xA3`$X3X$@
.A-ko+Pa+nK E3p
[color=blue]怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？5w|2Z,{g
[/color]参考见解：
1、 跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
2、 在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6，因为，如果质粒的量很浓的话，通过简单的对一条条带的目测产生的结果误差是很大的或者利用marker(推荐DL 2000),再用软件做半定量分析。s6O_)]^7cx O OS
[color=blue]变性单链DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率与什么有关？应该选用什么marker？marker上样时要变性吗？[/color]
参考见解：电泳迁移率(mobility)：如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，即：r{^ oJIYn
F = QE (1)带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律：;_"u\ CCQ/P)]A%c3e#x1Q
F’ = 6π r η v (2)这里v是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。
当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由(1)、(2)式推导出：
v Q
——— = ———— （3）Tm5f-F&Fs%M
E 6πr η D;h,F ` qGiU
不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下，颗粒在时间t中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度(1 V/cm)时的泳动速度：S8~P1cORaG
v d4o9rta:C U(~P0]"E
m = —— = ——— (4)
E t·E Z?,Gfj!Q
将(3)代入(4)，得到
Q"J'UWM;{,G0J+}{
m = ———— (5)
6πr+n)t Mv;[9?c)@8h
由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。o1m C#m*w(R@*u3M
[color=blue]请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？[/color]A%G#{ Hf @a6|&A
参考见解：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。 x|Rh4? j"y CFA t
一个让PAGE胶很快聚合的方法：~/|u7f r7Nf2x
不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。
^s4V$F-pk6I;}i
[color=blue]DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？[/color]*|Xx lQv a(RNL
参考见解：
1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。Kl e\ O3O:z
2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。
3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。
[color=blue]跑出的DNA带模糊？[/color]
参考见解：
1、 DNA降解：避免核酸酶污染。w K9fPUH
2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。zF)Z*DdQ fB
6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。"GF;} c9?o Si
3DHs _:G1L2W OwrQ
[color=blue]有不规则DNA带迁移?[/color]
参考见解： I+LKQG _6E
1、 对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。DU\KRE$c su
2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。
3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。*L \*N9ACi D
"J |\~LB_L
[color=blue]跑出的DNA条带带弱或无DNA带？
[/color]参考见解：
1、 DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。
3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。(B3D-s L p;D D
4、 对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。
[color=blue]跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?[/color]
参考见解：?#O2Y2|-|)]%N W `0k3p/x-[|
1、 小DNA带走出凝胶??缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 [HE GQ(js@I
2、 分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。%g!Lu Z*?S4Q(g2k
3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。
+P'l E TEY W0T4x
[color=blue]做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？ _g l o:B0a9zrG y4j
[/color]参考见解：有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
[color=blue]跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？
[/color]参考见解：还有个问题，pcr的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr。我试过，可是总是出现一个拖尾亮条，没有带，是什么原因呢？
割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。
&|1]%Ai'K.^x7plsF
[color=blue]凝胶回收DNA实验的关键在哪里?[/color]
参考见解：最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做充分,保证凝胶已经完全溶解了.加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度 的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。 Is(|7m^%^'I
[color=blue]切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？%X'M rJ tM |
[/color]参考见解：可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。
回复 #11 WANZHAN 的帖子
RNA 用具要用10%的NaOH浸泡过液，再用DEPC水冲洗干净 70%的乙醇用过 国产分析乙醇有杂质，RNA酶还会有，并带入其它污染 多谢楼主,非常好的内容,与其它几个帖子配合得太好了! 谢谢楼主！！！！！！！！ thank you:excellent: 好东东，谢谢！！！ 资料太好了! 谢谢!!!! 非常感谢LZ分享
页:
[1]
2