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WANZHAN 发表于 07-8-9 18:06

RT-PCR

[align=center][b]RT-PCR[/b][/align]fpG3j}*K
主要内容：
(Jmo*S\i1q1S
8z}I+VMH [list=1][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31297][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]原理[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31298][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]实验过程[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31299][color=blue][size=11pt]cDNA[/size][font=宋体][size=11pt]文库构建[/size][/font][/color][/url][size=11pt][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31300][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RNA[/font][/size][font=宋体][size=11pt]酶保护试验[/size][/font][/color][/url][/size][size=11pt][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31325][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]反应体系酶的选择[/size][/font][/color][/url][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31327][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]一步法同两步法的比较[/size][/font][/color][/url][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31328][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]反应体系的优化[/size][/font][/color][/url][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31330][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT[/font][/size][font=宋体][size=11pt]－[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]常见问题分析[/size][/font][/color][/url][size=11pt][/size][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8146&page=1#pid31331][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]RT-PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]应用[/size][/font][/color][/url][/size][/size][/list]9@zS!}9`(^Et?![
声明：Qt nv-Jjq i
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k"p*Ri.XYB 致谢：
QlC/W/VL-n^Y 整理者：WANZHAN   审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige88
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IO*]7c1xr 主要参考资料：《分子克隆实验指南》xbRv*D L:a7~
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|E)f$T2T [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:12 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-9 18:09

RT-PCR原理

[align=center][b]RT-PCR原理[/b][/align]
&a@W m9{U 　　RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
^9E"o&Z!K j-rr 　　RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。I0? bE%ME4}T
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：6{^N}UJFg&V:`
1、 依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
?(mJ2W)\-yX 2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；0\Go,Fr
3、 依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
l.H.i*o c;ru
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
!RW)D{)n'q(pZD [align=center][attach]1695[/attach][/align]d
`m(tiQzW
EE(fC*q6n\
[[i] 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 08:10 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-9 18:36

RT-PCR实验过程

**** Hidden Message *****H"_qD$Lq&[

#O!ACC:?)v%^bO-dG [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:13 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-9 18:42

cDNA文库构建

**** Hidden Message *****&cz&]
h"ZXkI4g y
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[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:14 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-9 18:45

RNA酶保护试验

**** Hidden Message *****lEHU:fX

uE&E7^0v [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:14 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-10 08:11

RT-PCR反应体系酶的选择

[align=center][b]RT-PCR反应体系酶的选择[/b][/align]6mN~iS YJ/o3@
[b]反转录酶的选择：[/b]:yS+A3Bg4^A7\1Q$NF_
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
#f(t;d&Q)e+SV3V 2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
w*j1R,]
p6iE 3． Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
8v$z d}/o O'p?nzQ 4． MMLV反转录酶的RNase H-突变体：Invitrogen公司商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。dF,p^\$Z_#h J'G
[b]扩增酶的选择:[/b]Hro9J6gi&g"p
1． 对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶。
n._?(BD5KA 2． 对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。
&L5X{!{hF6A 3． 对于大于12kb的产物使用ELONGAE? Enzyme Mix。n[a(iVL;d
4． 对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。
2X}FBr(t5YSP Tw
7~-{1~'|,t \}^ [[i] 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 08:20 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-10 08:32

RT-PCR一步法同两步法的比较

[align=center][b]RT-PCR一步法同两步法的比较[/b][/align]
9_$vb_w1rI 　　两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。 Ee!p/of^t
[align=center][table=92%][tr][td=1,1,293][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt][color=#000000]一步法[/color][/size][/font][/align][/align][/td][td=1,1,233][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt][color=#000000]两步法[/color][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt][color=#000000]起始第一链cDNA合成使用：[/color][/size][/font][/align][/align][/td][td][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt][color=#000000]起始第一链合成使用[/color][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt][color=#000000]Oligo(dT)[/color][/size][/font][/align][/align][/td][td][align=center][align=center][color=#000000][font=宋体][size=11pt]GSP[/size][/font][font=宋体][size=11pt]引物[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][align=center][font=宋体][size=11pt][color=#000000]随机六聚体[/color][/size][/font][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt][color=#000000] [/color][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][align=center][color=#000000][font=宋体][size=11pt]GSP[/size][/font][font=宋体][size=11pt]引物[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt][color=#000000] [/color][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt][color=#000000][b]优点[/b][/color][/size][/font][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt][b]优点[/b][/size][/font][font=宋体][size=11pt][/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]灵活[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]方便[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000]on
e_eph
[font=宋体][size=11pt]引物选择[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000]
#NxNd9}M [font=宋体][size=11pt]扩增酶同逆转录酶预先混合[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000]
6IGW'S2\ A7q [font=宋体][size=11pt]扩增酶的选择[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000]
;w5NY1y3ZRW sv [font=宋体][size=11pt]转管步骤少，减少污染可能性[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]困难RT-PCR的优化能力[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]高灵敏度[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000]&ZP`.c6@)^?.{}
[font=宋体][size=11pt]同Platinum®酶结合提高特异性[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]适用于大量样品分析[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000]r_9RA)i"UX}6Ns
[font=宋体][size=11pt]同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]适用于定量PCR[/size][/font][/color][/align][/align][/td][/tr][tr][td][align=left][align=left][color=#000000][font=宋体][size=11pt]•[/size][/font][font=宋体][size=11pt]适用于在单个样品中检测几个mRNA[/size][/font][/color][/align][/align][/td][td][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt][color=#000000] [/color][/size][/font][/align][/align][/td][/tr][/table][/align]

WANZHAN 发表于 07-8-10 08:43

RT-PCR反应体系的优化

**** Hidden Message *****
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Y)}\mm._[Y-D [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:16 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-10 08:56

RT－PCR常见问题分析

**** Hidden Message *****
S4]U1e,f-]0L'm!E(i
kEwwY Ad8f*I/B [[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:17 编辑 [/i]]

WANZHAN 发表于 07-8-10 09:09

RT-PCR应用

**** Hidden Message *****
|S,[HOb CN0NP1d}qT
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:18 编辑 [/i]]

longluruihua 发表于 07-9-14 14:29

回复 #1 WANZHAN 的帖子

你的帖子非常精彩！
0j-m4@\!B9v
8[sqv+H4`_4i
*I/U!C)Gw_^ 楼主，我想有个问题麻烦你！\pF]g3Jb8j1Oi
z Lt-e8G
我现在研发一种逆转录酶，我想对其进行长片段的验证，现在我找不到合适的材料，包括：RNA模板，PCR扩增引物，不知能否提供以下相关的材料？？
F0tH*[b[C(J
X#c8MlgtD+s 我这个酶的质量非常不错，是由中科院研发出来的一个双点突变逆转录酶，现急缺点长片断验证的材料，望楼主帮忙！！
Oa%K+WR9`+D9l(?&w G2?OW$?h
13910965206，[email]longluruihua@tom.com[/email]

WANZHAN 发表于 07-9-14 16:13

回复 #11 longluruihua 的帖子

longluruihua酷友，您好！感谢您对基因酷工作的认可，还希望您对不对或者不足的地方多多指点。关于您要的资源，基因酷现在还没有，您可以在资源求助区发布相应的求助贴，向广大酷友咨询一下:handshake 或者哪个有相关资源的酷友看到这个信息的话，可以同 longluruihua酷友联系！大家多多发扬互助的精神，共同进步:loveliness:

redkinds 发表于 07-9-29 23:04

很好的帖子,受益匪浅,谢谢楼主!

hedong 发表于 07-10-16 22:52

我应该早点看到这个论坛！！！

今天在坛子里闲逛的时候无意闯进了这个版块，里面的好东西实在是太多了！！！很多东西本来就是半懂不懂的，现在有醍醐灌顶的感觉，强烈感谢！！！！

香菱儿 发表于 08-2-18 19:59

Thanks!!!

yuqing-8277 发表于 08-2-27 16:47

谢谢，正好能用上！

tianhaoliang 发表于 08-3-4 11:42

谢谢搂主
%oDL-rq]@/Vx 顶一下

梦想在飞 发表于 08-3-6 20:54

非常感谢楼主

gao615615 发表于 08-3-11 21:43

xiexie谢谢

yanjin8088 发表于 08-3-19 16:01

太精彩了，感谢管理员.:excellent:

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