PCR
[align=center][b]PCR[/b][/align](Y%Q w9h#`0P主要内容：3s*Ri"b8l#V }&^ \
[list=1][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31257][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]技术的基本原理[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31261][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]反应体系与反应条件[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31263][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]扩增产物的分析[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31268][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]产物克隆[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31270][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]常用优化策略[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31272][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]反应特点[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31273][color=blue][font=宋体][size=11pt]针对[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]RNA[/font][/size][font=宋体][size=11pt]酶的一些注意事项[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31274][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]污染分析及对策[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=1#pid31275][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]常见问题分析[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31279][color=blue][size=11pt]PCR[/size][font=宋体][size=11pt]应用的部分简介[/size][/font][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31281][color=blue][font=宋体][size=11pt]原位[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31288][color=blue][font=宋体][size=11pt]荧光定量[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31291][color=blue][font=宋体][size=11pt]多重[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][/color][/url][color=blue] [/color][*][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31293][color=blue][font=宋体][size=11pt]定量[/size][/font][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][/color][/url][size=11pt][font=Times New Roman][/font][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][font=Times New Roman][color=blue][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31294]SSCP[/url][/color][/font][/size][size=11pt][/size][color=blue] [/color][*][size=11pt][url=http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=8142&page=2#pid31295][color=blue][size=11pt][font=Times New Roman]PCR[/font][/size][font=宋体][size=11pt]定点突变应用实例[/size][/font][/color][/url][/size][/list]Gc'N|,Qn ? \/f!_
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致谢：r'{8C |;x3e F
整理者：WANZHAN 审改者：小宝、纤夫、caterpillar、一头大水牛、kaige88lFPJt,} ?
主要参考资料：《分子克隆实验指南》
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[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-14 09:09 编辑 [/i]]
PCR技术的基本原理
[align=center][b]PCR技术的基本原理[/b][/align]类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍。扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为扩增效率, n为循环次数。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理论上）。对于某些扩增片段很短的PCR反应，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
[align=center][attach]1688[/attach][/align]
PCR反应体系与反应条件
**** Hidden Message *****7Kx2@E2qr fp
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:25 编辑 [/i]]
PCR扩增产物的分析
[align=center][b]PCR扩增产物的分析[/b][/align]PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。~ L p,O2}3qt5^W
1. 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外灯下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片段都应符合预计的大小，这是起码条件。3w t u m7ya
1、 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。
2、 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 G#T[$Kj |:Z~3P
聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好，其分辩力很高，甚至相差1bp的DNA片段也能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备和操作比琼脂糖凝胶复杂。t:TPEsuV g
2. 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的那切酶进行酶切，经电泳分离后，获得预期大小的片段，此法既能进行PCR产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。u7NA q7l&LV
3. 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Q+TQ iBb Mo2V
4. Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸),经标记后作为探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度。
5. 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，无阳性反应斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。+Q O X I*X`
6. 核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
PCR产物克隆
**** Hidden Message *****L&y ?%t~8N$b[Np&j.i g[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:25 编辑 [/i]]
PCR常用优化策略
**** Hidden Message ***** R)nfM!g&y,t7~)k?6@a"aEl G
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:26 编辑 [/i]]
PCR反应特点
[align=center][b]PCR反应特点[/b][/align]1. 特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过合理的引物设计，选择特异性和保守性高的靶基因区域，其特异性程度就会更高。'H n }pM5\
2. 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。%a)Nv ^2[e#z(E
3. 简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，可以不使用同位素，无放射性污染、易推广。
4. 对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。以源于临床标本（如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等）的粗制DNA进行扩增检测。
针对RNA酶的一些注意事项
[align=center][b]针对RNA酶的一些注意事项[/b][/align][b]防止RNA酶污染的措施：O C DKG!W/^
[/b]1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 { xP _4A&L1`
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
7. DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
8. 加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。-k |eR$uU
9. 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。 L5]e#P ei*i/x
[b]常用的RNA酶抑制剂[/b]X-W#|5U$P!A
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。,m8f M{-vV*h
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 I Qx NP h0sS [
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。"u6IFMJ;Tq r
[b]附：确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：[/b]
按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染分析及对策
**** Hidden Message *****&tedL.VM6MW0lx,MW
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:27 编辑 [/i]]
PCR常见问题分析
**** Hidden Message *****:v,pw A,\G nXj ~;@ `
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:27 编辑 [/i]]
PCR应用的部分简介
**** Hidden Message ***** L l-}[-E tQo3h Kf8{|
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:28 编辑 [/i]]
原位PCR
**** Hidden Message *****XtG"e ~.XlQ[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:29 编辑 [/i]]
荧光定量PCR
**** Hidden Message *****[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:29 编辑 [/i]]
多重PCR
**** Hidden Message *****8D K:d G4`"f V(r ?L v x`
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:30 编辑 [/i]]
定量PCR
**** Hidden Message *****#[?p(Gc.r:z"g uG!U
[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:31 编辑 [/i]]
SSCP
**** Hidden Message *****B Z2R%V'Nb[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:31 编辑 [/i]]
PCR定点突变应用实例
**** Hidden Message ***** vM+vKdJ,pO j[[i] 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:32 编辑 [/i]] 多谢楼主精彩的帖子,谢谢了! 多谢楼主发帖啊，以后要继续努力啊 感谢啊，第一次见到有关于PCR这么全的东西！下载三hou