【核酸技术】（转贴）DNA,蛋白质,RT-PCR方法总结
【核酸技术】（转贴）DNA,蛋白质,RT-PCR方法总结蛋白质检测－Western Blot 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10． 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11． 按步骤9洗涤。 12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动1小时。 13． 按步骤9洗涤。 14． 配制显色指示剂/底物：混合显色指示剂原液3.0ml，PBS 9.0ml，加入1%过氧化氢150.0微升。立即使用。 15． 于室温下摇动直至出现紫色并开始看到背景（1~10分钟）。 16． 将薄膜转到另一盛水容器中洗涤，终止显色反应，空气干燥，封入塑料袋中避光保存。
DNA（基因）检测－Southern Blot 中DNA吸印转移 1．室温下将电泳后的琼脂糖凝胶浸入500ml溶液A中，摇动30分钟后换500ml新鲜溶液A再摇30分钟，使DNA双链碱变性。溶液A： 5M NaCl 300.0ml 10M NaOH 50.0ml H2O 650.0ml 2．为使凝胶重新回到中性，换入溶液B中重复上述1过程。溶液B： 10M 乙酸铵 200.0ml 10M NaOH 4.0ml H2O 1796.1ml 硝酸纤维素薄膜（NC膜） 3．料盒或盘中放一玻璃板支架，倒入10×SSC，将Whatman 3MM滤纸放在玻璃板上，两头浸在液体中，用玻棒赶除气泡。 4．心地将琼脂糖凝胶翻过（扣过来）滑到纸上，放平、赶除气泡。 5．将预先浸于溶液B中的NC膜，平铺在胶上，用玻棒赶除气泡。 6．在膜上放置两层预先以10×SSC浸湿的Whatman 3MM滤纸。 7．再放6张干燥吸水纸及4堆3cm厚的折叠吸水纸。 8．在纸上覆盖玻璃平板，板上可置约250g重物，下部缓冲液根据虹吸原理能被吸上来，凝胶上的单链DNA即可被吸出并转移到NC膜上。转移速度取决于DNA片段的大小。<1kb的片段在0.7％的胶中2小时即可转出，而15kb的片段需15小时以上，一般维持12～24小时。 9．转移完成后，将胶与膜取出，通过样品槽、表明记号，并剪去膜的一角，以识别方向，此时膜与胶正面观察的方向是一致的。 10． 去掉胶，令膜稍加干燥，用圆珠笔标号。 11． 如为硝酸纤维素膜，则用3MM滤膜包好，80℃烘烤2小时。若为尼龙膜则用紫外等照10分钟，使DNA牢固地结合于膜上，即可用于分子杂交。 12． 将膜在6×SSC中浸泡几分钟，放入塑料袋，按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液，排净气泡封闭袋口，在68℃水浴中振动预杂交2～4小时。 13． 取出塑料袋，在一角切一缺口，倒出预杂交液，按50μl/cm2膜面积加入杂交液，排净气泡、封口，再于68℃水浴中振动杂交，一般来源于真核细胞的总DNA，需杂交12～16小时。 14． 杂交结束后取出塑料袋，剪开边缘，迅速将膜转到2×SSC和0.5％EDTA溶液中室温下洗涤（振荡）5分钟，再将膜转移人2×SSC和0.1％SDS溶液中洗涤15min，然后将膜浸入0.1倍SSC和0.5％SDS溶液中68℃振荡洗涤2小时，换同样溶液再洗涤30分钟。 15． 取出滤膜在Whatman滤纸上晾干，放入塑料袋或用塑料纸包好，在暗室中将X光片与滤膜接触，封于曝光夹中，进行放射自显影1～15天。 16． X光片被取出。常规显定影后显示杂交情况，如曝光时间不够可重新放入X光片再次曝光，直到带型显示清晰。
Rt-PCR经验总结中生网 | [url]http://www.seekbio.com[/url] Rt-PCR实验步骤
一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸：2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
三、试剂配制： 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml？ pH8.0 蒸溜水 1000ml 5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0%： 1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的Rt-PCR材料：（生工. Tel. 2236106.） Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1支 110 —— -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies —— 4℃ Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成 1、内参照： GAPDH 正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′ 反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′ β-actin 正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′ 反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′ 2、par-4: 正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′ 反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′ 3、退火温度计算 2（A+T）+4（G+C）正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃） 4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好 5、引物稀释：加DEPC水量为（μl） = ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点： 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？ 2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前，打开离心机预冷。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 mRNA的分离与纯化 真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
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