求助：引物TM温度相差太远！20度啊！K
本人这段序列有2100KB，GC含量超高，要连到PEYFP载体上，设计酶切位点，没想到序列中只有两个能用。庆幸有两个。可是引物犯难了。加了酶切位点后，这温度竟然有78度，而另一条竟然只有58度。由于片段太长，所以在1170BP的长度又设计了一对引物。这里有个BCLI的酶切位点。请各位给我指点一下，我这样设计的引物行吗？正向[font=Arial]TCCGGA [/font][font=Arial]ATGGCGGGCATCGCG78度
BspEI (KpnII)[/font][font=Arial][size=12pt] [/size][/font]
[font=Arial][size=12pt]反向 AAGCTT[/size][/font][font=Arial][size=12pt] TCAAAGTACTGAGAAACAG
57度[/size][/font][font=Arial][size=12pt]
HindIII
[/size][/font]
[font=Arial][size=12pt] [/size][/font]
[font=宋体][size=12pt]中间引物：正向：[/size][/font][font=Arial][size=12pt]ACATTCTGGATGAACCCTCAGTA
58度 GC含量：43.5%[/size][/font]
[font=Arial][size=12pt]反向： CTCATCCTCCTCCTCCAGCT
58度
[/size][/font][font=Arial][size=12pt]GC含量：[/size][/font][font=Arial][size=12pt]
60%[/size][/font] 我师姐说算TM值不用算酶切位点的碱基 啊，我自己做的时候也没算，能扩出来。你先试一下吧。GC含量高用宝生物的GC BUFFER，还可以
页:
[1]