【交流】自制T载体的方法 以及省钱的好处
本来是回帖，但勾起了挺多的想法，所以专门开一贴，想和大家交流讨论一番。本帖主要包含三部分：[b][color=Red]一.自制T载体，也是商业化T载体的构建主要是以下两种方法（附文献两篇,请见附件）：[/color][/b]
1、是平端酶切+dT法：也就是将出发载体用平端酶（EcoR V，Sma I等等）处理线性化后，利用rTaq在双链的3‘端随机加单核苷酸的活性（首选的dA），将线性化载体，rTaq，dTTP在rTaq的反应体系中（1×Buffer）72度温浴1~2hr即可
此方法的缺陷有+dT的效率受载体的浓度，纯度，rTaq的活性影响很大，因而效率不稳定，自连率较多，但有几个方法可以有效改善此法，一是+dT后，将载体回收，用CIAP处理，这样没用加dT的线性化片段引起的自连就大大降低；二是改用ddTTP代替dTTP，这样即可以保证只加单碱基，提高与3’dA突出片段的连接效率，也可以降低自连。
2、是特殊酶切位点的单酶切：此法是利用部分内切酶的识别位点，而切出单dT突出的粘性末端。举几个例子，就是
Xcm I：
[size=2]5'-CCA NNN N[color=Red]N[/color]^N NNN TGG-3'
5'-GGT NNN N^[color=Lime]N[/color]N NNN ACC-3'[/size]
Eam1105 I
[size=2]5'-G A C N N [color=Red]N[/color]^N N G T C-3'
3'-C T G N N^[color=Lime]N[/color] N N C A G-5'[/size]
N代表的是随机碱基的核苷酸，因此可在载体中加入两个该切点（具体方法参见[url]http://bbs.genecool.com/thread-14653-1-1.html[/url]），前一个的红色碱基是T，后一个红色碱基是A，如下
[size=2]5’-[color=Yellow]CCAAgCT[/color][color=Red]T[/color][color=Yellow]CCCATgg[/color]Cg[color=Yellow]CCATgTC[/color][color=Red]A[/color][color=Yellow]TgAgTgg[/color]
3‘-[color=Yellow]ggTTCgA[/color][color=Lime]A[/color][color=Yellow]gggTACC[/color]gC[color=Yellow]ggTACAg[/color][color=Lime]T[/color][color=Yellow]ACTCACC[/color][/size]这样用Xcm I线性化后，就产生了两端都带3‘dT的线性化载体也就是T载体。
[size=2][b]5’-[color=Yellow]CCAAgCT[/color][color=Red]T[/color] [color=Yellow]TgAgTgg[/color]-3‘
3‘-[color=Yellow]ggTTCgA[/color] [color=Lime]T[/color][color=Yellow]ACTCACC[/color]-5’ [/b][/size]
此法的有点在于效率高，完全线性化的载体自连率很低，我们自己做的一般自连率不超过10%，但由于需要的内切酶不像rTaq那样便宜，因而不太适合大规模制备。
我们自己在用酶切法做，是先改造了pBluescript II KS（+）,在它的MCS区加入了两个Xcm I，每次制备大提一批改造载体，Xcm I单切2hr，回收，验证一下自连率，使用即可。一般公司，比如我们常用的pMD18T,19T，20T，以及promega的pGEM-T系列都是用的第一种方法，仔细看看它们的连接点就知道，都是EcoR V残基+dT，但它们的自连率很低，这就和他们的+dT的手段，以及+dT后的处理有关了，但大部分也就是上面提到的两点。
我们自己的感觉是，平时克隆片段是肯定没有问题，但做要求较高的实验，比如某些建库的实验，不仅要求自连少,还要求连接的效率要高，以防丢失部分信息，因此还是用商业化的T载体好一点，毕竟稳定压倒一切。
[b][color=Red]二、自制T载体的优势：[/color][/b]
上面说到，商业化T载体最具压倒性的优势就是稳定，自制似乎只有成本降低了（也有观点认为由此造成的不稳定，可能引发更大的浪费）。但我自己认为自己做的T载体还有一个最大的好处，就是你可以改造载体的时候，随便在在连接点的两端加东西，创造“个性化的T-Vector”。这其实也是其他自制的东西和商业的东西的优势。
一个例子：你可以把较短的表达载体改造成T载体，这个具体的便利之处我就不用废话了吧？看看满版的酶切克隆问题，你就知道如果能用TA克隆连入目的片段是多么幸福的事。（这里之所以提一句短的表达载体，是因为我自己心里没底，我自己有做pET17（3.3kb），效果不错，后来为了带His×6 Tag，去改造pET28a，效果却非常不理想，具体原因不知，但我也只做了一次，是不是长载体就不行，我也不敢说。毕竟改造载体这类的活，在非必须的情况下，老板不会鼓励你去做，因此我也是闲的时候，兴趣驱动，做这些也都是玩的心态，出来了好，老板也乐意，出不来还要深究的话，老板就会说不务正业了。）
再一个例子，比如在原位杂交的探针制备上，由于一般的商业T载体都是奔着万用载体的目标去得，因此在连接点和T7/T3/SP6 promotor之间加了很长的切点序列，这其实在原位杂交的探针制备中是不利的，因为相当于在RNA探针中带入了无义的非特异序列，因此很多人选择直接在PCR引物的两端加Promotor，而用PCR的产物做转录模板，但这样有增加了引物合成的费用和可能的PCR实验的不利。因此如果在Xcm I类的切点两侧直接加T3/T7/SP6 promotor+一个单切点（方便线性化，确定转录终点），就可以造出非特异片段较少的探针模板了。
[color=Red][b]三、省钱的好处[/b][/color]
至此，废话完毕，主要是想到实验室里的两派，一派非进口的东西不做，认为“不要为老板省钱”，一派则真正做到一分钱两半花，恨不得拖拉机上高速。在这里我个人表态是不支持任何一派（嘿嘿，中国人式的中庸）。首先实验，尤其是分子生物学的实验，这种东西看不见摸不着，有的时候药品试剂的等级不同是会造成结果的不稳定，你非要用化学纯的东西跑HPLC，那跑出来肯定背景N高；但是“不为老板省钱”这个从心态上就是不对的，所谓低调求生存，你全用最好的，老板会让你发低点数的文章么？就算发了，你不觉的这是杀鸡用牛刀么？我不认为老把自己和老板发到对立面来考虑事情是个好事情，是有些老板比较“抠”，但其实这些自制东西的配方很多都是从很牛老外的实验室“偷”过来的，我有和这些老外交流过，说你们也不缺钱，为啥rTaq都要自己做？人家回答公司做的不放心，我无语了……也许这就是自信和不自信吧。
当然我也不是说能做都自己做，只是说在实验允许的前体下，尽量合理的节约，这也是对自己能力的锻炼吧，为什么非要说成是“省老板的钱”呢？省钱的前提是实验允许，因此你必须非常了解实验的要求和影响因素，才可能知道那些可以省，那些不能省，所以省钱的同时你也深入理解了实验，这样分析实验，处理结果的时候也会更加得心应手，你总不能指望所有的实验结果跑出来都和产品说明书上的一样吧？
[[i] 本帖最后由 biobowl 于 08-10-6 19:01 编辑 [/i]] 厉害啊，下来看看先
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