有自己做T载体的吗
如题，老板不知道受什么刺激了非要自己做T载体。。。尝试N久了，都不行，自连很高，不知道有没有高人做过或见过可行的方案步骤的麻烦介绍一个，谢谢了 我们实验室就是自己做，曾经尝试过两种方法：1、是平端酶切+dT法：也就是将出发载体用平端酶（EcoR V，Sma I等等）处理线性化后，利用rTaq在双链的3‘端随机加单核苷酸的活性（首选的dA），将线性化载体，rTaq，dTTP在rTaq的反应体系中（1×Buffer）72度温浴1~2hr即可
此方法的缺陷有+dT的效率受载体的浓度，纯度，rTaq的活性影响很大，因而效率不稳定，自连率较多，但有几个方法可以有效改善此法，一是+dT后，将载体回收，用CIAP处理，这样没用加dT的线性化片段引起的自连就大大降低；二是改用ddTTP代替dTTP，这样即可以保证只加单碱基，提高与3’dA突出片段的连接效率，也可以降低自连。
2、是特殊酶切位点的单酶切：此法是利用部分内切酶的识别位点，而切出单dT突出的粘性末端。举几个例子，就是
Xcm I：
5'-CCA NNN N[color=Red]N[/color]^N NNN TGG-3'
5'-GGT NNN N^[color=Lime]N[/color]N NNN ACC-3'
Eam1105 I
5'-G A C N N [color=Red]N[/color]^N N G T C-3'
3'-C T G N N^[color=Lime]N[/color] N N C A G-5'
N代表的是随机碱基的核苷酸，因此可在载体中加入两个该切点（具体方法参见[url]http://bbs.genecool.com/thread-14653-1-1.html[/url]），前一个的红色碱基是T，后一个红色碱基是A，如下
5’-[color=Yellow]CCAAgCT[/color][color=Red]T[/color][color=Yellow]CCCATgg[/color]Cg[color=Yellow]CCATgTC[/color][color=Red]A[/color][color=Yellow]TgAgTgg[/color]
3‘-[color=Yellow]ggTTCgA[/color][color=Lime]A[/color][color=Yellow]gggTACC[/color]gC[color=Yellow]ggTACAg[/color][color=Lime]T[/color][color=Yellow]ACTCACC[/color]
这样用Xcm I线性化后，就产生了两端都带3‘dT的线性化载体也就是T载体。
5’-[color=Yellow]CCAAgCT[/color][color=Red]T[/color] [color=Yellow]TgAgTgg[/color]-3‘
3‘-[color=Yellow]ggTTCgA[/color] [color=Lime]T[/color][color=Yellow]ACTCACC[/color]-5’
此法的有点在于效率高，完全线性化的载体自连率很低，我们自己做的一般自连率不超过10%，但由于需要的内切酶不像rTaq那样便宜，因而不太适合大规模制备。
我们自己在用酶切法做，是先改造了pBluescript II KS（+）,在它的MCS区加入了两个Xcm I，每次制备大提一批改造载体，Xcm I单切2hr，回收，验证一下自连率，使用即可。一般公司，比如我们常用的pMD18T,19T，20T，以及promega的pGEM-T系列都是用的第一种方法，仔细看看它们的连接点就知道，都是EcoR V残基+dT，但它们的自连率很低，这就和他们的+dT的手段，以及+dT后的处理有关了，但大部分也就是上面提到的两点。
我们自己的感觉是，平时克隆片段是肯定没有问题，但做要求较高的实验，比如某些建库的实验，不仅要求自连少,还要求连接的效率要高，以防丢失部分信息，因此还是用商业化的T载体好一点，毕竟稳定压倒一切。
[[i] 本帖最后由 biobowl 于 08-10-6 15:50 编辑 [/i]]
谢谢大虾
非常感谢你的回复，我实验室也做这个很久了，就是结果不理想，你们做的好用吗，自连高不高。页:
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