基因酷 基因库 Genecool » PCR技术讨论 » 求助：退火温度做梯度摸索两对引物 PCR2KB却始终无结果。

starLFD 发表于 08-10-3 09:39

求助：退火温度做梯度摸索两对引物 PCR2KB却始终无结果。

各位帮我分析一下我的问题：目的片段长度为2KB.
第一个基因：正向引物：ATGGCGGGCATCGCGGC Tm 60
反向引物：TCAAAGTACTGAGAAACAGAGAGCCAAGA  Tm61.9 两个引物都没有设计酶切位点，因为本人实验室所买的酶在目的序列中都存在。
本人从48-60度设定梯度摸索TM，可始终无目的条带。已经做了很多遍温度范围后来加高到50-64度，也是无结果。尝试68度两部法也无结果。我的反应体系是
100ul  buffer 10ul
          dNTP   10ul
          primer1  2.5ul (稀释后终浓度0.2uM)
           primer2 2.5ul (稀释后终浓度0.2uM)
          水         64ul
         模板      10ul
         easyTag   1ul   (5U/ul)
每管20 UL体系。
请大家指点。
多谢


另有一个基因2.1KB也是采取同样的手段去PCR，可始终无结果。
正向引物：ACTCGAGAAATGTCGGAGGAGATCATCAC
反向：AGAATTCTCATGCAAACATGGTCAGC
后又在起始子和终止子的上下游设计了一对引物也没任何结果。不知道为什么。本人还曾尝试PFU，LONGTAG酶，也丝毫无结果。

tieniu03 发表于 08-10-3 10:30

老兄,可以研究一下模板,PCR中P的不来是常见的
模板的纯度是重要的因素啊,若有杂质会影响TAQ酶的活性,甚至无法扩增,
另外,100ul体系的PCR我还真的没有做过,楼主可以试试减低一点,

若仍然P不出来,楼主也可以尝试套式PCR

starLFD 发表于 08-10-3 21:15

我的模板借给实验室其他人，别人很容易的就可以P出来，不管采取什么酶。模板质量很好。我也用20ul的小体系实验，已经一个月了，还是没任何结果。今天尝试加5%DMSO,结果还是不行。

starLFD 发表于 08-10-5 09:35

成功了一半

昨天我用touchdown pcr,P出来第二个2。1KB的基因，但是第一个基因没有P出来。
我的模板是CDNA，从ATG前设计引物能行吗？不知道如何进行多次PCR进行重叠延伸，小妹我刚进实验室，第一次做PCR，就要P这么长的片段，唉！

[[i] 本帖最后由 starLFD 于 08-10-7 09:36 编辑 [/i]]

nano 发表于 08-10-5 20:21

第一个引物，实际Tm应该大约在70°了，GC含量太高了，缩短两个碱基试试，既然是cDNA模板，还不至于太担心特异性的问题。反向引物算得还差的不太远
第2个基因两个引物GC含量还差得不算远

starLFD 发表于 08-10-5 21:41

回复楼上的，我的序列很难搞，设计引物时已经问了很多人，他们都说序列就这样所以只能这样设计。我觉得我可能要在设计一对引物才行。

nano 发表于 08-10-6 22:04

回复 6# 新新酷友 的帖子

呵呵，我不是说了解决办法了吗，你愿意的话试试再说。
我用软件算的你上游引物Tm是超过了70°，GC含量接近80%，所以要你上游引物再减2个碱基试一下，再减两个碱基Tm也在60以上，足够了

caohuasheng 发表于 08-10-8 20:57

1.我上个月刚扩了一个引物和模板中GC含量均很高的基因，试过了easy tag ,la tag,pfu等等（以为是模板问题，还提过几次RNA），最后发现不是模板和引物的问题，换了一种高GCbuffer后 ，很容易就扩出来了，我不知道你的基因内部情况怎么样，但是从引物（正向）看起来好像GC含量还比较高，你可以买这种BUFFER试一下(宝生物有卖，55元1.25ml)。
2.模板是CDNA，可以从ATG前设计引物，但是有几点要注意：你设计引物的5UTR必须是真实存在的，你可以先找到包含完整UTR的CDNA；如果你后期还要做原核表达或者超表达的话，注意设计引物的时候不要使后期的表达出现移码突变或者提前终止！

caohuasheng 发表于 08-10-8 21:06

还有一点忘记说了，最好像nano版主说的那样先把Tm值降下来再说。我当时能扩出来也是因为Nano版主劝我先把引物减少了几个之后才做出来的，在这里还得谢谢Nano版主:excellent:

loxyang 发表于 08-10-8 23:27

你模板是什么浓度啊，有时候模板不纯加多了反而扩不出来。还有，你分析一下模板的GC 含量，如果GC 含量很高，用一般的BUFFER不容易扩出来。我原来扩的模板GC含量快到百分之七十了，用一般的BUFFER扩不好，最后用宝生物的GC BUFFER很快就出来了。

starLFD 发表于 08-10-10 20:32

我的模板GC含量是50%左右，也不算是很高了。引物我重新设计了。这个片段长度是2105BP我在1164的位置酶切位点前后设计了一对引物，将基因分成两段来P，现在是我新设计的引物。
正向1. TCCGGA ATGGCGGGCATCGCG  78  BspEI (KpnII)

3.AAGCTT TCAAAGTACTGAGAAACAG    57 HindIII

BCLI 中间引物：正向：4.ACATTCTGGATGAACCCTCAGTA    58   
2.CTCATCCTCCTCCTCCAGCT    58

caohuasheng 发表于 08-10-12 05:35

为什么要分成两段来P啊，2.1KB的应该还比较容易扩的啊。只要你引物设计的时候避开GC富集的地方，你可以从5UTR端开始设计引物，再把RNA质量提好点，逆转录做好一点，扩2.1KB应该不是很难的事情啊

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