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小猫儿 发表于 08-8-29 14:21

表达一个不带标签的蛋白的后果会怎样？

手上有几个膜蛋白要做抗体，表达出来肯定是包涵体，之前做过带his标签的，柱上复性，现在为了赶进度，想直接切胶免疫，于是打算干脆在标签前设计终止子，直接把蛋白表达了去免疫。
           但是有师兄说，这样做不能够保证我得到的诱导蛋白就是目标产物，而且蛋白上没有标签，后期做western等实验可能会有问题。
           想请问各位，在不需要使用标签纯化或者增加可溶性的情况下，能否直接表达不带标签的蛋白？

nano 发表于 08-8-29 19:57

当然可以，而且还有专门用来形成包涵体的载体。但是膜蛋白很可能会无法表达

xiaofeixia 发表于 08-8-30 00:03

膜蛋白好像比较难表达，我现在就遇到这种情况了

小猫儿 发表于 08-8-30 09:52

为什么会有载体专门形成包涵体呢？呵呵，为了减少对细胞的毒性吗？
膜蛋白一般都疏水的氨基酸比较多，而且对细胞有一定毒性，所以很难表达……唉

xiaofeixia 发表于 08-8-30 13:13

楼主有没有想到什么办法来改进表达？蛋白不表达，郁闷啊

小猫儿 发表于 08-8-30 13:30

我能想到的就这么几个：换载体，缩短诱导时间

xiaofeixia 发表于 08-8-30 13:49

我的还有个稀有密码子问题，现在到处找菌株呢，先把这个问题解决了，再考虑下一步。我想也是把菌的浓度摇得稍微高一点再做诱导，把诱导时间缩短一些，具体可能要做个时间梯度来确定

nano 发表于 08-8-30 20:16

越是难表达，一般应该更早诱导，多数情况都是因为表达产物毒性问题造成
形成包涵体又很多好处1.容易纯化 2.表达量一般很大 3.一定程度下可以降低对宿主毒性

xiaofeixia 发表于 08-8-30 20:35

但是一诱导，菌就不长了，蛋白也没表达，不过现在不能确定是什么原因。请问nano版主：我的蛋白700多aa，前180个密码子里有15个稀有密码子算不算多？有好些都是间隔4-5个密码子就有一个，会不会影响表达？

nano 发表于 08-8-31 08:39

15个稀有密码子当然算多了，如果有连续的，就更难表达

xiaofeixia 发表于 08-8-31 09:35

谢谢nano超版，看来真得先把这个问题解决了再考虑其他了

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