求助，重组质粒问题出在哪里？？？
本人在做原核表达，使用的载体为pET28a（5369bp），插入的目的基因为约500bp.本人做法是将目的基因先插入克隆载体pMD19-T中，经测序正确后，再切下目的基因,纯化后连接到经酶切纯化后的表达载体上。现今出现的问题是：当目的基因与表达载体连接后所提的重组质粒跑出来的电泳总是显示的位置在10，000bp以上，按理应该是在5，000多才对的，酶切验证也不见我的目的片段。我做了重组质粒的PCR鉴定，电泳显示却有我的目的片段。
本人考虑到是否是载体自连现象，如若是自连酶切后应该有载体条带，可酶切后却仍然只有在10，000以上的那条带出现。另外，我做连接后转化平板就长出来很多的白斑，无法看出单菌落，后做梯度稀释来挑的单菌落，而且，将表达载体pet28酶切后，应该切出来200bp,但电泳没有看到，我使用的酶是NCOI和HindIII.不知道是否在这个酶切的地方就出了问题？？请求高手指点，谢谢！！
另外，我得到的重组质粒电泳显示条带总是很弱，后又采用乙醇沉淀10倍浓缩，浓度稍微提高了些。
请求大家帮助，谢谢！！！
[[i] 本帖最后由 hchqiu 于 08-8-24 11:12 编辑 [/i]] 是正常的，质粒会产生多级结构，螺旋等，这必然导致分子量大！至于酶切问题，老实说HindIII这个酶切位点不太容易切开，你方可采取加热质粒后再切，若仍然没有目的片段，就重新做吧！
若你不太相信，方可去测序！
转化问题，可能你连接时质粒过多了，可以减少。涂板要涂均。 多谢tieniu03的指点！！
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