基因酷 基因库 Genecool » 蛋白技术讨论 » 是否可以利用酵母发酵表达GST融合蛋白

sunb2008 发表于 08-8-21 16:25

是否可以利用酵母发酵表达GST融合蛋白

用细菌表达量很低很低，所以想用酵母试试，不知道有什么利弊，请大家指教。

nano 发表于 08-8-21 19:59

那就没必要用GST了，酵母不形成包涵体，可以用纯化更容易的HIS-TAG

sunb2008 发表于 08-8-21 21:08

有什么利弊吗

hamye 发表于 08-8-22 09:53

如2楼，酵母表达不用考虑可溶性的问题。表达后纯化是否方便是你设计要考虑的，因为GST tag纯化后还要酶切，所以后面会比较麻烦。

nano 发表于 08-8-22 15:12

GST在纯化后还存在于你的样品中，不容易除去，咪唑的话透析超滤都可以直接去除

sunb2008 发表于 08-8-22 18:15

GST其实不用切除，我们是直接拿去打抗体的，以前在细菌中表达也是这样做的。
在细菌中我们是利用GST的beads将GST融合蛋白带出来，不知道这种纯化方法可不可以移植到酵母

还有一般使用什么方法破细胞啊？

[[i] 本帖最后由 sunb2008 于 08-8-22 18:52 编辑 [/i]]

nano 发表于 08-8-22 20:03

做抗体你用酵母表达那可难得纯化到足够的量了，除非你要求有糖基化等修饰的抗原
还是建议回去考虑如何优化发酵

小猫儿 发表于 08-8-23 11:27

破细胞的方法不少啊，对于细菌来说一般用冻融，溶菌酶，或者超声
一般电泳的话冻融或者煮沸离心一下就行
做后面的纯化，还是要好好用超声仪超声

sunb2008 发表于 08-8-23 17:19

回复 7# 超级版主 的帖子

已经优化很多条件了，看貌似结果还是不行，这种蛋白很难溶的

hamye 发表于 08-8-23 20:37

那你有没有分析难以表达的原因？细胞毒性还是其他的？
可以试下论坛里介绍的自诱导系统。
另多试下其他载体。
发酵也是可以考虑的，一般用10L的罐子发酵一批量就很可观了。

nano 发表于 08-8-23 21:38

[quote]原帖由 [i]sunb2008[/i] 于 08-8-23 17:19 发表 [url=http://www.genecool.com/bbs/redirect.php?goto=findpost&pid=83435&ptid=18506][img]http://www.genecool.com/bbs/images/common/back.gif[/img][/url]
已经优化很多条件了，看貌似结果还是不行，这种蛋白很难溶的 [/quote]
很难容就干脆使用形成包涵体的载体，反正做抗体也不需要可溶

sunb2008 发表于 08-8-24 00:45

主要是怕后面纯化会很难，gst挂不上beads。

nano 发表于 08-8-24 07:08

包涵体就不需要挂什么柱子了，直接粗纯化跑胶免疫

sunb2008 发表于 08-8-24 12:24

土问跑胶免疫是怎么样的啊

nano 发表于 08-8-24 19:54

请查阅《分子克隆》1、2版，上面说得很清楚，论坛里我也回答过很多次了，搜索一下

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