zz关于稳定转染真核细胞的鉴定
[b][font=宋体][size=11pt]关于稳定转染真核细胞的鉴定（即外源基因在真核细胞的表达）[/size][/font][/b][b][size=11pt]——[/size][/b][b][font=宋体][size=11pt]一些个人体会（转载）[/size][/font][/b][b][size=11pt] [/size][/b]
[align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]真核细胞稳定转染的实验周期较长，从构建载体、转染、筛选单克隆、扩大培养直到鉴定，加起来个把月的时间就扔进去了。而且更重要的是后续实验的延续性，只有对转染细胞的质量进行严格控制，才能满足实验的需要。因此，对转染细胞的鉴定是很慎重的问题，常用的方法有：[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][size=11pt]
1. Western blot([/size][font=宋体][size=11pt]蛋白水平，首选[/size][/font][size=11pt])[/size][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]利用[/size][/font][size=11pt]Western blot[/size][font=宋体][size=11pt]技术，对转染后细胞内是否有目的蛋白[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]的表达进行检测。这里，需要设置好阴性对照和阳性对照。举例说明：例如，我的载体里面有[/size][/font][size=11pt]HIS-tag[/size][font=宋体][size=11pt]标记，那我就可以用[/size][/font][size=11pt]HIS-tag[/size][font=宋体][size=11pt]抗体检测细胞中目的融合蛋白[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]－[/size][/font][size=11pt]HIS[/size][font=宋体][size=11pt]的表达情况。当然，如果手里有针对目的蛋白[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]的抗体那就更方便了，直接用它就可以了。[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]阴性对照：稳定转染空载体的细胞的裂解液[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]阳性对照：表达[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]蛋白的细胞；或者体外表达[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]蛋白的大肠杆菌的菌体裂解液[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]在进行[/size][/font][size=11pt]SDS-PAGE[/size][font=宋体][size=11pt]的时候，将实验组，阴性对照，阳性对照同时在一板胶上电泳，然后转印、杂交、显影。最理想的结果是：阴性对照无带；而实验组和阳性对照出现与目的蛋白[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]分子量相近的条带，且二者位置相当（当然，如果检测的是融合蛋白，则融合蛋白分子量＝目的蛋白[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]的分子量＋[/size][/font][size=11pt]Tag[/size][font=宋体][size=11pt]的分子量）。[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][size=11pt]
2. RT-PCR[/size][font=宋体][size=11pt]（[/size][/font][size=11pt]mRNA[/size][font=宋体][size=11pt]水平）[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]通过[/size][/font][size=11pt]RT-PCR[/size][font=宋体][size=11pt]检测目的基因[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]的转录情况。在进行扩增时要注意设置阴性对照和阳性对照。[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]阴性对照：[/size][/font][size=11pt]RT[/size][font=宋体][size=11pt]反应时，将反转录酶用[/size][/font][size=11pt]ddH2O[/size][font=宋体][size=11pt]代替，其余成分同实验管，同时进行反转录反应后，用[/size][/font][size=11pt]PCR[/size][font=宋体][size=11pt]反应观察能否扩增得到目的片段。[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]阳性对照：以表达该目的基因[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]的细胞作为[/size][/font][size=11pt]RT[/size][font=宋体][size=11pt]反应的[/size][/font][size=11pt]RNA[/size][font=宋体][size=11pt]来源，同法进行[/size][/font][size=11pt]RT-PCR[/size][font=宋体][size=11pt]；或者以含有目的基因片段的质粒[/size][/font][size=11pt]DNA[/size][font=宋体][size=11pt]作为[/size][/font][size=11pt]PCR[/size][font=宋体][size=11pt]模板，进行[/size][/font][size=11pt]PCR[/size][font=宋体][size=11pt]反应。[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]在将[/size][/font][size=11pt]PCR[/size][font=宋体][size=11pt]产物进行电泳的时候，将实验组，阴性对照，阳性对照同时在一板胶上电泳，最理想的结果是：阴性对照无带；而实验组和阳性对照有相应大小的[/size][/font][size=11pt]DNA[/size][font=宋体][size=11pt]片段出现，且二者位置相当。[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]但是，切记鉴定实验不是就此结束了，还有一个重要的实验：测序！！如果不经过测序的验证就直接下结论说细胞里有[/size][/font][size=11pt]X[/size][font=宋体][size=11pt]基因的表达，未免有些武断。（个人的感觉是：[/size][/font][size=11pt]RT-PCR[/size][font=宋体][size=11pt]的结果若不经测序验证，心中惴惴不已，何谈信心去做下一步实验。）[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][size=11pt]
3. [/size][font=宋体][size=11pt]其他[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=left][align=left][font=宋体][size=11pt]如原位杂交，免疫荧光，免疫细胞化学，活细胞[/size][/font][size=11pt]GFP[/size][font=宋体][size=11pt]观察等则见仁见智，各位酷友可以在文献中[/size][/font][size=11pt]search[/size][font=宋体][size=11pt]看看！[/size][/font][size=11pt][/size][/align][/align][align=center][align=center][font=宋体][size=10pt] [/size][/font][/align][/align][font=宋体][size=11pt]基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、[/size][/font][size=11pt]DEAE[/size][font=宋体][size=11pt]葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电穿孔等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后[/size][/font][size=11pt]48[/size][font=宋体][size=11pt]小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，[/size][/font][size=11pt]48[/size][font=宋体][size=11pt]小时后即可进行靶基因表达的检测等实验（即[/size][/font][font=宋体][size=11pt]瞬时转染[/size][/font][font=宋体][size=11pt]）。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（[/size][/font][size=11pt]hygromycin[/size][font=宋体][size=11pt]）和新霉素（[/size][/font][size=11pt]neomycin[/size][font=宋体][size=11pt]）。筛选后可以得到稳定表达外源基因的细胞克隆，这就是[/size][/font][font=宋体][size=11pt]稳定转染[/size][/font][font=宋体][size=11pt]。[/size][/font]
[font=宋体][size=11pt]稳定转染和瞬时转染的区别就是在转染后是否用药物筛选。[/size][/font][size=11pt][/size]
[align=center][align=center][font=宋体][size=10.5pt]我常采用的方法是RT-PCR鉴定目的基因的mRNA，然后进行间接免疫荧光鉴定，最后是WB，一般经过这3步基本上可以明确稳定转染的成功与否。
此外还需注意几点：
1，采用RTPCR法鉴定的时候，最好用DNA酶处理一下提取的RNA然后再进行RT－PCR，以避免残留的质粒或其他污染。 [/size][/font][/align][/align][align=center][align=center][font=宋体][size=10.5pt]
2[/size][/font][font=宋体][size=10.5pt]，采用WB的时候需要注意，如果表达水平一般不是很好，采用HRP-DAB或者HRP-TMB系统，其检测灵敏度在100pg以下，可能不能满足你用来检测真核细胞蛋白表达检测的需要，建议采用灵敏度更高的化学发光WB检测。[/size][/font][/align][/align][font=Calibri] [/font]
回复 1# 的帖子
呵呵，我说怎么瞅着眼熟，这个应该是基因酷的原创帖子，原帖在这里：[url]http://www.genecool.com/bbs/viewthread.php?tid=2406&page=1#pid8190[/url]
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