求助：诱导表达后电泳无目的片段出现
我最近在做原核的蛋白诱导表达，但一直没有蛋白表达，不知是何故？我做的具体情况如下：
我用的菌株为：Rosetta-gami(DE3)pLysS5，载体为：PET27b（＋）
在含适当抗生素的琼脂平板上划线，挑单克隆于含适当的LB培养基中，一般5个小时后，测OD值为0.5，然后加IPTG至终浓度为1mM，温度在30度下，转速为280，诱导5个小时，每隔一个小时去1ml的样。完后跑SDS-PAGE电泳。但无目的蛋白出现。
已经做过几次了，结果都一样。
现在不知是什么原因请做过类似的达人指点！谢谢！
[[i] 本帖最后由 taoli 于 08-5-6 23:06 编辑 [/i]] 论坛里其他人发过的类似话题，借鉴一下吧
原核表达个人秘笈：表达前的分析比什么都重要
[url=http://bbs.genecool.com/viewthread.php?tid=50&highlight=%E5%8E%9F%E6%A0%B8%E8%A1%A8%E8%BE%BE]http://bbs.genecool.com/viewthre ... 8%E8%A1%A8%E8%BE%BE[/url]
【转载】原核表达遇到瓶颈怎么办
[url=http://bbs.genecool.com/viewthread.php?tid=6513&highlight=%E5%8E%9F%E6%A0%B8%E8%A1%A8%E8%BE%BE]http://bbs.genecool.com/viewthre ... 8%E8%A1%A8%E8%BE%BE[/url] 根据你的描述我还不是很清楚具体的原因，希望你能够描述的更加详细些！
首先根据我自己的个人经验来分析下：
1.构建出来的单克隆必须要进行测序以确认，得到的克隆为你自己想要的阳性克隆。如果是载体自连上的单克隆菌落，你去做诱导表达，连目的片段都没有连上去，怎么可能会有目的蛋白表达呢！
2.建议你做个菌落pcr进一步确认下你所得到的克隆就是你想要的阳性克隆。
3.你是将单克隆直接接到培养基中进行摇菌诱导表达的，建议可以提前一晚进行单菌落接菌，然后次日早上按1：100的比例接菌到新的培养基中（一般我们测试用5mlLB培养基接50ul过夜菌液）。这样可保持菌有良好的生长状态，你直接用刚摇起来的菌去诱导（OD600 0.5左右是吧？）这样菌才刚适应环境你就去诱导他，相当于让一个刚会走的孩子去干体力活，及时能够诱导成功的话，那么他的表达量绝对是及其低的！所以你可以先考虑用过夜菌摇起来后再进行诱导，这样对你的目的蛋白的表达量也是会有很大提高的。
4.iptg的浓度问题，并不是iptg的浓度越高你的诱导表达量就越大，对于不同的菌来说所适用的iptg的浓度是不同的，具体要靠你自己根据文献资料进行测试摸索来确定。iptg浓度太高的话会对菌有毒害作用，影响菌体的生长。
5.对于应该在什麽位置进行诱导，一般文献上都是0.6-0.8之间，这个你想要确定你自己的菌的生长曲线也很简单，你可以专门摇管菌用于测定生长曲线（一般每隔一个小时测定下OD值）。 6.对于诱导前后的温度及转速要求，一般37度就可以，转速诱导前后都保持在160rpm每分钟，刚开始进行测试时没有必要再诱导时将温度及转速进行调整，变量太多对于你的实验顺利摸索并不是一件好事，个人经验温度及转速不改变也没有出现很大影响（只是自己实验的感觉，仅供参考）
7.你诱导后收集菌体进行电泳的思路是正确的，不知道你是怎么样收集的，建议参考数据为：5000转 10分钟。速度不能够太大。
8，收集后不知道你是否进行了后续的处理，例如加溶菌酶裂解菌体，或反复冻融。因为这一步处理很重要，如果没有处理好目的蛋白无法释放出来就会导致你所描述的这种现象！若是直接用菌体电泳的话建议你用5*loading buffer进行样品处理上样。
9.电泳图结果的分析：如果说胶上什么都没有的话没可能是你样本处理过程中或电泳时出了问题，如果电泳条带上有菌体本底蛋白条带出现，而没有目的蛋白出现，那么可以考虑目的蛋白是否裂解出来或是否有形成包涵体的可能。
10.实验是一个苦中求乐的过程，学会享受收获经验的快乐。祝你成功！！ 同是天涯沦落人啊
我都做一个多月的表达了
条件摸了几十个都没有表达出来呢
这个诱导表达虽然主要影响因素就那么几个但是范围很广啊
要看自己的实验设计了
还有要靠一点点运气
哈哈
回复 4# 的帖子
首先十分感谢你的解答！:qq60:你说的那些问题我也注意到了（我是按照novagen的PET手册来进行操作的）：
1.我挑的菌株是经过测序，并且我对摇出来的菌液进行了PCR检测，都正常！
2.我挑的单克隆是和你说的，在5ml的LB中过夜培养，第二天进行1：100的稀释培养到OD600＝0.5
3.至于IPTG的浓度，我也是按照PET手册，同时我也做过浓度梯度实验，也是没结果。
4.温度我是这么想的，因为温度高的话容易形成包涵体，所以我诱导的时候就把温度由原来的37度调为30度。
5.菌体的收集转速也不大.
6.菌体的裂解是通过“反复冻融”进行的。
最后再次感谢真诚的解答！！！ 你所遇到的这种情况我以前也遇到过，不过做了几次后来发现是在菌体处理上发生了问题，直接加了溶菌酶15min后，没有经过反复冻融就离心取上清电泳了，结果目的蛋白带基本没有看到东西，其他本底的一些条带有但是量也很低，如果说你的菌可能形成包涵体的话，那么建议将菌体沉淀用尿素或盐酸胍进行下处理再电泳看看沉淀中是否有东西。
回复 7# 的帖子
那我就再请教一下你反复冻融的具体操作是怎么样的？我是用液氮进行速冻的，然后放到60度的水中进行溶解。
不知你是这么做的？ 我们一般所用的操作方法是：菌体用buffer重悬后，-80度放置30分钟，然后75度放置30分钟；共反复进行三次！最后融后用4度，12000rpm/min 离心15分钟，收集上清液进行电泳。 直接加LOADING BUFFER煮了离心上样就行了 [quote]原帖由 [i]nano[/i] 于 08-5-7 20:33 发表 [url=http://www.genecool.com/bbs/redirect.php?goto=findpost&pid=68166&ptid=16310][img]http://www.genecool.com/bbs/images/common/back.gif[/img][/url]
直接加LOADING BUFFER煮了离心上样就行了 [/quote]
确实，鉴定有无表达，直接煮就可以了。没必要破菌。
但准备纯化样品就要复杂点。 呵呵。。是这样的，但是一般我们的量比较大，考虑到后面的纯化，所以这里所说的仅仅是个人经验而已，呵呵。。 我还想问一下，培养基对诱导有影响吗?
我一直用LB的培养基进行诱导的，是不是用其他的一些培养基对诱导有促使作用，比如：PET手册上说的M9 TB 等？ 建议你看下这个帖子：[url]http://bbs.genecool.com/thread-14646-1-1.html[/url] 你用的gami 是亮氨酸缺失型的，我不知道你在培养基内加了没有，要不它是不表达，或表在量很低的 楼上的酷友，有联系方式吗？留个？
有重要问题请教！
谢谢！
回复 3# 版主 的帖子
想请问您一下，用过夜的菌去诱导，那菌不都处于衰退期了吗？那诱导还有用吗？回复17#的帖子
3#的意思是先过夜活化，次日转接，再诱导。他后面的那句话是有一点点歧义，呵呵 呵呵，我是先过夜接菌，第二天再1：100接了去增殖，LB培养基3个小时OD600就能达到0.5以上，加IPTG 37度诱导4小时收菌煮样电泳就好了。结果出来还算好，和未诱导的比有明显的条带，只是量少点。有空可以大家讨论下怎么样才能有大量表达！页:
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